【０１０３】
健康な被験者についての我々の先の試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βが活性化ＣＤ＋Ｔ細胞を誘導し、Ｉｇ産生を下方制御することから、本試験でＳＬＥ患者からのＣＤ８＋Ｔ細胞の単離および処置を試みた。先の試験が不成功であったのは、自発的抗体合成に顕著な可変性があること、および細胞分離法のために活動性ＳＬＥ患者からの大量の血液を必要とすることであった。しかし、我々は、活動性ＳＬＥの患者の１人から十分な血液を得ることができ、抗ＣＤ２誘導ＩｇＧ合成のＣＤ８＋Ｔ細胞調節に対するＩＬ−２およびＴＧＦ−βの効果を調べた。抗ＣＤ３とは異なり、抗ＣＤ２モノクローナル抗体のマイトジェン性組合わせが、ＰＢＬを誘導しないで、ＩｇＧを産生することを、我々は最近� ��告した(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。例を図４Ａに示す。これは、抗ＣＤ２がＮＫ細胞を刺激してＴＧＦ−βを産生し、それが順番にＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、抗体産生を下方制御するためであった(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。この患者において、我々が以前に報告したように(Gray J. D. et al. (1994), J Exp Med 180:1937-1972)、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩｇＧ合成を増加し、ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組合わせにより増加が著しく強化された(図４Ａ)。一方、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＳＬＥ ＣＤ８＋Ｔ細胞のヘルパー効果を無くし、これらの細胞がＩｇＧ産生を抑制することを可能にした。ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのこの阻害効果はＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に依存した(図４Ｂ)。このように、ＩＬ−２およびＴＧＦ−β効果がＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介され得るという証拠が得られた。
【０１０４】
これらの試験は、ＰＢＭＣのＩＬ−２およびＴＧＦ−βへの短い暴露により、ＳＬＥ、特に重症な疾病の患者および著しいＢ細胞活動亢進の患者において、続く自発的ポリクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生を大きく減少できることを証明した。この試験は、ＩＬ−２が抗体産生を阻害できることを示す先の報告(Hirohata, S. et al. (1989), J Immunol 142:3104-3112およびFast, L. D. (1992), J Immunol 149:1510-1515)を確認し、ピコモル濃度のＴＧＦ−βがこの下方制御の一因となり得ることを明らかにする。試験した１２名の患者のグループにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βのポリクローナルＩｇＧ合成に対する阻害効果は、ＩＬ−２単独より大きかった。しかし、ＩＬ−２の阻害活性は異なっていた。試験した８名のうち４名において、阻害はＴＧＦ−β依存的であり、中和化抗ＴＧＦ−β ｍＡｂが作用を無くした。残りの例において、ＩＬ−２の下方制御効果はＴＧＦ−β非依存的であった。同様に、自発的抗ＮＰ自己抗体産生におけるＴＧＦ−β依存的および非依存的阻害の両方が証明された。また、我々がＩＬ−１０の拮抗およびＴＮＦ−α添加についての効果を調べたのは、ＳＬＥにおけるこれらサイトカイン産生の異常について、先に記載されていたためである(Llorente L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. et al. (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。しかし、これらの方法は、リンパ球が先に活性化されているとき、自発的抗体合成に対する最小の効果を示した。
【０１０５】
ＳＬＥにおけるＢ細胞活動亢進の程度が疾病活動性と相関するという他の報告がある(Blaese, R. M. et al. (1980), Am J Med 69:345-350; Klinman, D. M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410)。このことが本試験で起きなかったのは、同時薬剤治療によるためであろう。概して、著しい自発的抗体合成の患者は処置せず、かわりにＢ細胞活性が低い患者にはプレドニゾンを普通に投与した。我々はコルチコステロイド治療開始後に著しく自発的ＩｇＧ合成が減少した一つの例を提示する。この患者のＢ細胞は、処置前に抗ＮＰ抗体も分泌したが、この自己抗体の産生はステロイド治療後に検出されなくなった(データは示していない)。
【０１０６】
ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節において重要なサイトカインの多機能性ファミリーから成る(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641)。ＴＧＦ−βは、不活性前駆体分子として分泌され、細胞外で生物学的活性形に変換する点で、多くの他のサイトカインと異なる(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641; Flaumenhaft, R. et al. (1993), Adv Pharmacol 24:51-76)。実験的自己免疫脳炎(Weiner, H. L. et al. (1994), Annu Rev Immunol 12:809-837)および大腸炎(Neurath, M. F. et al. (1996), J Exp Med 183:2605-2516)のような種々の実験的自己免疫モデルは、このサイトカインを産生する。ＴＧＦ−βは、ナノモル濃度で免疫抑制性であり、ＴおよびＢ細胞増殖、ＮＫ細胞の細胞毒性活性およびＴ細胞の細胞毒性発生を阻害できる(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162)。対照的に、ＴＧＦ−βはマウスＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖を促進する(Kehrl, J. H. et al. (1986), J Exp Med 163:1037-1050; Lee, H. M. et al. (1993), J Immunol 151:668-677)、およびＢ細胞分化を促進できる(Van Vlasselaer, P. et al. (1992), J Immunol 148:2062-2067)と報告されている。
【０１０７】
健康な被験者から得たリンパ球で調節性Ｔ細胞を発生させるという先の試験において、使用したＴＧＦ−βの濃度は、ＴまたはＢ細胞機能の阻害に必要とされるピコモル濃度より低かった(Gray, J. D.ら（1998）,J Immunol 160:2248-2254；Gray,J. D.ら（1994），J Exp Med 180：1937-1942)。同様の濃度をＳＬＥ患者での本発明の試験において使用すると、ＴＧＦ−β自体が抗体合成に対して僅かな阻害効果を有していた。前記の通り、ＴＧＦ−βとＩＬ−２の組み合わせが最も強力な阻害をもたらした。先の試験において、この効果はＣＤ８＋ Ｔ細胞により仲介された。
【０１０８】
ＩＬ−２について、Ｔ抑制細胞活性の誘発に対する効果が十分確立されている(Hirohata，S. ら（1989),J Immunol 142：3104−3112；Fast，L. D.，J Immunol 149：1510-1515)が、これらの効果が直接的なものであるか、または間接的なものであるかどうかは明らかではない。マウスにおいて、ＩＬ−２遺伝子の欠失は、大量のリンパ球増殖および自己免疫疾患を生ずる(Sadlack，B.ら（1995）,Eur J Immunol 25：3053-3059)。ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２レベルとＢ細胞機能亢進との負の相関関係が報告されている(Huang，Y. P.ら（1988)，J Immunol 141:827-833)。以前、ＳＬＥでＩＬ−２によって自発的Ｉg産生を阻害しようと試みたが、しかしながら、その結果は極めて可変的であった。強い阻害を幾つかの場合において観察したが、一方で他のＩＬ−２では抗体産生が著しく増大した。我々は、時期およびサイトカイン環境により、この試験で見られる阻害よりもさらに一定した阻害が説明されると考える。ここで、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、全培養期間というよりはむしろ、最初の７２時間の培養の間にしか存在していなかった。後者の事例での抗体合成の増加は、Ｂ細胞分化に対するＩＬ−２の正の効果によって説明し得る(Coffman，R. L.ら(1988)，Immunol Rev 102:5-28)。ＩＬ−２は、抗体産生を幾つかの機構により下方制御することができる。該報告に記載されているＴＧＦ−β回路に加えて、ＩＬ−２が誘発する阻害は、ＩＦＮ−γの上方制御(Noble，A.ら(1998)，J Immunol 160:566-571)により、または細胞溶解機構(Stohl，W.ら(1998)，J Immunol 160:5231-5238;Esser,M. T.ら(1997)，J Immunol 158:5612-5618)により起こり得る。
【０１０９】
以前、我々は、抗体合成に対するＮＫ細胞の調節効果を調べ、ＮＫ細胞の直接的効果がＩgＧ合成を上方制御することである(Kinter，A.ら(1995)，Proc Natl Acad Sci USA 92：10985-10989)が、これらのリンパ球が、正常な被験者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞との培養の場合、正反対の効果を有すると報告した(Gray，J. D.ら(1994)，J Exp Med 180:1937-1942)。しかしながら、ＳＬＥ患者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせがＩgＧ産生を高める(Linker-Israeli，M.ら(1990)，Arthritis Rheum 33：1216-1225)。これは、本発明の報告において再び観察された。正常な被験者では、ＮＫ細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞に添加すると、抗ＣＤ２刺激ＩgＧ合成を著しく阻害したが、正反対のことがＳＬＥにおいて観察された。標準的試験から、ＮＫ細胞から得たＴＧＦ−βがＣＤ８＋Ｔ細胞の同時刺激を誘発して、ＩgＧおよびＩgＭ産生を下方制御することがわかった(Gray，J. D.ら(1998)，J Immunol 160：2248-2254)。この試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞による中程度の抑制活性を誘発した。従って、ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βがＢ細胞活性を阻害する少なくとも１つの方法は、調節性Ｔ細胞を発生させることによるものであるらしい。加えて、これらまたは他のサイトカインで処理した他のリンパ球群もまた、ＳＬＥにおけるＢ細胞活性を下方制御し得る。
【０１１０】
実施例２
疾患の活性および重症度とＴＧＦ−β産生との相関関係
全体および活性型のＴＧＦ−βのリンパ球産生が減少することが分かったので、次に、これらの欠失が疾患の活性および／または重症度と関連があるかどうかを調べた。１７人の検査したＳＬＥ患者から得た血液リンパ球によるＴＧＦ−β１産生を、１０人の慢性関節リウマチ(ＲＡ)患者および２３人の適応す� �健康な対照と比較した。ＲＡにおける活性ＴＧＦ−β１のレベルは、対照より低かったが、ＳＬＥにおける程度までは減少しなかった。ピコモル量で検出される構造性ＴＧＦ−β１および抗ＣＤ２刺激された活性ＴＧＦ−β１のレベルは、最近発症の非常に活性で重症なＳＬＥのために入院した６人の未処置患者において著しく減少し、処置され活性の低い疾患の１１人の患者においても同様に減少した。このように、活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性とは関連がなかった。これとは対照的に、全ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性と逆の相関関係があった。このように、ＴＧＦ−β１の潜在性前駆体のリンパ球分泌の欠陥は、疾患活性の結果として生じ得るが、前駆体分子をその活性型に転換する能力は、内因性細胞欠失とな り得るようである。活性化される時点でのピコモル濃度量のＴＧＦ−β１へのＴ細胞の不十分な暴露は、抗体合成の下方制御の欠陥を生じ得る。このように、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少は、この疾患に特徴的なＢ細胞機能亢進に起因するのであろう。
【０１１１】
方法
試験の被験者
ＳＬＥの分類に関するアメリカ大学のリウマチ病学基準(Tan，E. M.ら(1982)、Arthritis Rheum 25：1271-1277)を満たすＳＬＥ診断を受けた１７人の被験者、ＲＡの分類に関するＡＣＲ １９８７ 改定基準 (Arnett，F. C.ら(1988），Arthritis Rheum 31:315-324)を満たすＲＡ診断を受けた１０人の被験者、および２３人の健康なドナーを試験した。ＳＬＥグループは、女性１５人および男性２人(スペイン人１５人、アフリカ系アメリカ人１人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、３４.５歳(範囲：２０−７５歳)であった。６人の患者を入院させて、１１人を外来診療所に通わせた。入院患者は皆、入院するまでは未処置であり、試験した後、彼らに第一回用量のコルチコステロイドを投与した。外来患者には、プレドニゾンを２０mg未満を投与し、誰にも細胞毒性薬物を投与しなかった。疾患の活性を、平均値が各々６.６および７.６であるＳＬＡＭ(Liang，M. H.ら(1989)、Arthritis Rheum 32:1107-1118)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier，C.ら(1992)、Arthritis Rheum 35:630-640)指数で評価した。ＲＡグループは、女性９人および男性１人(スペイン人９人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、５０.９歳(範囲：３９−６７歳)であった。患者は皆、外来診療所に通わせ、軽度〜中程度に疾患活性を有していた。疾患の平均期間は９.５年であった。１人の患者にマイオクリシン(myochrysine)を投与し、３人の患者にプレドニゾン(１、１および２０mg)を投与し、３人の患者にメトトキサレートを投与し、１人の患者にスルファサラジンを投与した。健康なドナーを対照として、年齢、性別、および民族グループに関して可能な限り厳密に適応させた。
【０１１２】
表５
ＳＬＥ患者の２つのグループの臨床的特徴
【表５】

【０１１３】
試薬
使用した抗体は、抗ＣＤ２を分泌するハイブリドーマ(ＯＫＴ１１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)，Rockville，MD、およびＧＴ２は、Alain Bernard博士，Nice，Franceにより入手可能となった)の上清であった。ＴＧＦ−βイソ型 １、２、および３(１Ｄ１１)を認識するモノクローナル抗体、ＴＧＦ−βイソ型 ２および３(３Ｃ７)に対する抗体、並びにrＴＧＦ−β２は、Bruce Pratt博士(Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA)により快く提供された。
【０１１４】
血液リンパ球の単離
先に記載した方法(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)を使用して、Ｆicoll−Ｈypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ)密度勾配遠心分離により、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をヘパリン処置した静脈血から調製した。単核細胞を、５mＭ ＥＤＴＡ(Life Technologies, Grand Island，NY)を含むＰＢＳで洗浄して、ＴＧＦ−βの豊富な原料である血小板を取り除いた。連続Ｐercoll(Pharmacia)密度勾配によって、末梢血リンパ球(ＰＢＬ)を遠心分離によりＰＢＭＣから分離した。高密度のリンパ球に富む画分に残留する単球のパーセンテージは、ＳＬＥにおいて幾分高かった(８.５％ 対 ４.３％)。
【０１１５】
細胞培養方法
細胞培養方法は、以前に記載されている(Ohtsuka，K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。簡単に言えば、１×１０⁵個のリンパ球を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート(Greiner Rocky Mountain Scientific，Salt Lake City UT)のウェルに加えた。血清が著しい量の潜在性ＴＧＦ−βを含むことから、培養をＡＩＭ−Ｖ血清不含有培地(Life Technologies)で行った。抗ＣＤ２を最適濃度で使用して、ＴＧＦ−β産生(ＧＴ２ １：４０およびＴ１１ １：８０)ハイブリドーマ培養上清を誘導した。先の試験は、抗ＣＤ２がＰＢＬを強く刺激して、ＴＧＦ−βを産生することを明らかにしている(Gray，J. D.ら(1998),J Immunol 160：2248-2254)。
【０１１６】
ＴＧＦ−βアッセイ
ルシフェラーゼ・リポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害剤(ＰＡＩ−１)プロモーターを含む発現構築物をトランスフェクトしたイタチ肺上皮細胞(ＭＬＥＣ)は、Ｄ. Ｂ. Ｒifkin博士，Ｎew Ｙork，ＮＹにより快く提供された。２×１０⁴／ウェルのＭＬＥＣを上清２００μlと共に３７℃で１８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性についてアッセイするために、ＭＬＥＣを細胞溶解試薬(Analytical Luminescence，Ann Arbor，MI)により溶解した。次いで、細胞溶解物をアッセイ緩衝液およびルシフェリン溶液(両方とも、Analytical Luminescenceから得た)と反応させた後、直ちに、照度計(Lumat，Berthold Analytical Instruments Inc.，Nashua，NH)で測定した。全ＴＧＦ−β活性を測定するために、試料を８０℃で３分間加熱して、潜在性複合体から活性サイトカインを放出させた。上清を加熱することなく、活性ＴＧＦ−βの活性を測定した。全てのアッセイおいて、幾つかの濃度のrＴＧＦ−βが標準曲線を作成するために含まれていた。同型培養の可変性は１０％未満であった(Ohtsuka,K.ら(1998)，J Immunol 160:2539-2545)。
【０１１７】
統計解析
ＧＢＳＴＡＴソフトウェア(Professional Statistics and Graphics Computer Program，Dynamic Microsystems Inc.，Silver Spring，MD)を使用して行うマン‐ホイットニー（Ｍann−Ｗhitney）試験およびＳpearman順位相関関係を使用して、結果の有意性を解析した。
【０１１８】
結果
ＳＬＥまたはＲＡの患者由来のＰＢＬにより産生される構造的および刺激されたＴＧＦ−β１を測定し、正常対照の値と比較した。培養上清中で検出されるサイトカインは、イソ形１、２および３を認識するｍＡｂで中和されたが、イソ形２および３に対するｍＡＢではされず、結果としてＴＧＦ−β１の産生を確認した。正常対照と比較して、活性ＴＧＦ−β１の構造的産生はＳＬＥで有意に減少した(１４±４対５６±２１pg／ml、ｐ＝０.０２、図５)。抗ＣＤ２刺激活性ＴＧＦ−β１も減少した(８７±２２対３９９±１０３pg／ml、ｐ＝０.００３)。ＲＡにおいて、構造的Ｔ� �Ｆ−β１の平均値は、ＳＬＥ(１９±５pg／mg)と同様であり、抗ＣＤ２により刺激された後、正常とＳＬＥの中間値であった(１９７±５４pg／ml)。
【０１１９】
リンパ球により産生された構造的全ＴＧＦ−β１も、正常グループと比較してＳＬＥで減少した(２８６±８２対６３１±１８５pg／ml、ｐ＝０.０５)。ＲＡでの値は、正常とＳＬＥの中間値であった(４３５±１６１pg／ml)。抗ＣＤ２の添加に続き、全ＴＧＦ−β１はＳＬＥで正常対照より幾分増加したが、差異は統計学的に有意でなかった。ＲＡグループでの値も正常とＳＬＥグループの中間値であった。
【０１２０】
ＴＧＦ−β１の減少したレベルと疾病活動性の相関関係の可能性を調べるために、ＳＬＥの入院患者と外来患者とを比較した。これらの２つのグループの臨 床的特徴は、表５に要約する。入院患者の方が若かった；６名中５名が、３ヶ月以内の症状を示し；そして、著しく活動的な疾病に罹患していた；そして殆どが、腎炎および／または溶血性貧血を伴う重症ＳＬＥであった。比較して、外来患者は、処置により活動性が低くなった慢性疾病であった。疾病異種性、期間、活動性および重症度の著しい差異にもかかわらず、構造的および刺激ＴＧＦ−β１産生は、正常対照と比較して両グループで有意に減少した(表６)。
【０１２１】
【表６】

【０１２２】
活性および全ＴＧＦ−β１のレベルと疾病活動性との相関関係をみると、全ＴＧＦ−β１の抗ＣＤ２刺激産生は、ＳＬＥＤＡＩ指数と有意な負の相関関係があるが(ｒ＝０.５５、ｐ＝０.０３）、ＳＬＡＭ指数とは相関がなかった(−０.４３、ｐ＝１１)。ＳＬＥＤＡＩ指数は、中枢神経系関与および腎臓疾患に重きを置く。このように、ＴＧＦ−β１の前駆体形を分泌するリンパ球の能力の減少は、重症な疾病と関連するように見える。活性ＴＧＦ−β１のレベルは、疾病活動性と相関しなかった。
【０１２３】
本例での主な発見は、ＳＬＥでの活性ＴＧＦ−β１の産生減少が、疾病活動性または重症度と相関しないことである。構造的および刺激活性のＴＧＦ−β１量の減少は、最近発症した疾病および確立� ��た疾病の両方の患者で見られた。更に、この値は、ＳＬＡＭおよびＳＬＥＤＡＩ指数で測定して活動性と、または生体臓器関与により評価した重症度と相関しなかった。しかし、全ＴＧＦ−β１産生がＳＬＥで減少もするが、この欠失は疾病活動性と相関するように見えた。これは、主として入院ＳＬＥ患者で見られた。全ＴＧＦ−β１産生が主要な臓器系関与に重きを置くＳＬＥＤＡＩ指数と最も相関するというこの発見はまた、疾病重症度との関係を示す。
【０１２４】
この試験はまた、確立された疾病のＳＬＥ患者と疾病活動性が同等であるＲＡ患者の対照グループを含む。ＲＡグループでのＴＧＦ−β１値は、構造的活性ＴＧＦ−β１以外、正常対照より幾分低いが、欠失の強度はＳＬＥ程著しくなく、統計的に有意ではな� �った。
【０１２５】
以前に、我々は、ＮＫ細胞がＴＧＦ−βの主なリンパ球源であり、このサイトカインを活性形で構造的に産生する唯一のリンパ球集団であることを証明した(Gray, J. D. et al., (1988), J. Immunol. 169:2248-2254)。従って、ＮＫ細胞由来ＴＧＦ−βの構造的産生はＳＬＥで減少しているとの発見は、興味深かった。我々はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの両方が活性ＴＧＦ−βの産生を促進できることを知った。これら両サイトカイン産生はＳＬＥで減少する(Gray J. D. et al., (1994), J Exp Med 180:1937-1942)。しかし、殆どの患者において、外来性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αはＴＧＦ−βを正常に回復できなかった(実施例２)。ＩＬ−１０産生はＳＬＥで増加し(Llorente, L. et al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421))、増加したレベルと疾病活動性の相関関係が報告されている(Housslau, F. A. et al. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. et al. (1996), Arthritis Rheum 39:379)。ＩＬ−１０はＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−β産生を阻害できる(実施例２およびMoore, K. W. et al. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190)。活性ＴＧＦ−βの産生が軽いおよび活動性の疾病の患者で減少したこと、およびＩＬ−１０の拮抗によって産生欠失を部分的にしか回復できなかったことは(実施例２)、増加したＩＬ−１０産生自体がＳＬＥにおけるＴＧＦ−β１のリンパ球産生の減少について説明となり得ないことを示す。数個の機構が恐らく関与するのであろう。潜伏性前駆体の成熟活動性形への細胞外変換における１個またはそれ以上の欠失がこの異常性を説明し得る。
【０１２６】
ＴＧＦ−βは、リンパ球増殖およびエフェクター細胞機能に対する阻害特性が詳細に説明されているが(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev. Immunol 16:137-162)、刺激特性も報告されている(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-677)。ＴＧＦ−βは、刺激Ｔ細胞およびその産生の上方制御によりサイトカイン産生を調節する。マウスにおいて、ＴＧＦ−β１は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を選択的に活性化して増殖させ(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-667)、ナイーブ細胞からメモリーＴ細胞への成熟を増加する(Lee, M. H. et al. (1991), J. Immunol 147:1127-1133)。ヒトにおいて、ＴＧＦ−β１はエフェクターＴ細胞の強い誘発物である(Cerwenka, A. et al. (1994), J Immunol 153:4367-4377)。免疫抑制作用には大量(ナノグラム／ml)が必要であるが、我々が示したように、抗体産生の下方制御効果に関してＣＤ８⁺Ｔ細胞を共刺激するのには、少量(ピコグラム／ml)でよい(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。
【０１２７】
そのため、これらの試験によると、ＴＧＦ−β１の潜伏性前駆体のリンパ球分泌の欠失が疾病活動性の結果として起こり得るが、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、さらに複雑であり、数個の異なる機構からもたらされる。ナイーブＴ細胞が抗体産生を下方制御するように計画するには、Ｔ細胞が活性化される時点でpg／ml量の活性ＴＧＦ−βの存在を必要とすると我々は考え、またこの考えを支持する証拠がある(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:2248-2254)。従って、決定的な時点での局所環境におけるピコモル量の活性ＴＧＦ−βを欠くことは、ＳＬＥにおけるＢリンパ球活性を制御するＴ細胞調節機能の無効によるのであろう。
【０１２８】
実施例３
マイトジェンでのＳＬＥの処置
本実施例において、ＩｇＧ産生は、調節組成物で細胞を処理することにより下方制御される。この調節組成物はマイトジェン抗ＣＤ２モノクローナル抗体組合せ物のようにマイトジェンを含む。これら抗体は、可溶化形態で添加するか、ビーズ上に固定化して、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の受容体と橋かけ結合せしめる。これらの細胞は、上記の実施例で説明したように調製し、次いで、マイトジェンとインキュベートし、増幅した。抗体産生が下方制御された細胞数が増加す� �。ＣｏｎＡはシグマから入手できる（St. Louis, MO）。
【０１２９】
抗ＣＤ２がどのように機能するかは知られていないが、これら抗体がＰＢＭＣ調製物中においてＮＫ細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βを分泌し（Ohtsuka, K. et al.(198), J. Imunol 160: 2539-2545）、次いでＴＧＦ−βが働いて、Ｔ細胞が抗体抑制細胞となると考えられている。
次いで、細胞を必要であれば洗浄し、患者に移植し戻す。
【０１３０】
実施例４
サイトカインとマイトジェンの混合物での細胞の処理
細胞を上記のように調製して、抗体産生を下方制御する細胞集団を誘導するために、マイトジェンとサイトカインの混合物を含む調節組成物で細胞をインキュベートした。この手法の例は、図４Ｃにおいて示す。この実施例において、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞をＣｏｎＡ、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βで処理して、抑制に関する最大誘導を得た。
【０１３１】
患者に再移送される調節性Ｔ細胞の調製のために、抗ＣＤ２および／または抗ＣＤ３モノクローナル抗体をＣｏｎＡ� �代わりに使用して、Ｔ細胞を活性化する。調節組成物は、ＩＬ−２を伴いまたは伴なわずに、ＴＧＦ−βを含有する。この細胞を、例えば、Nexell 300i. Magnetic Cell Selection System のような閉鎖系中で標準インキュベーション技術を用いて４〜７時間、組成物と共にインキュベーションした。
【０１３２】
インキュベートの後、細胞をＨＢＢＳと洗浄して、溶液中のサイトカインおよびマイトジェンを除去する。所望により、ビーズ上に固定した抗ＣＤ３±抗ＣＤ２８と培養して、細胞数を増加さす。次いで、細胞を２００−５００mlのＨＢＢＳ中に懸濁し、患者に再挿入する。
【０１３３】
実施例５
細胞の細胞仲介免疫を正常化する処置
ＳＬＥの自己抗体産生に対する要因は、ＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスにある。ＩＬ−１０のレベルは過多で、ＴＮＦ−αレベルは低い［Llorente et al. 1995. J. Exp. Med. 181:839-44，Houssiau, F.A. et al., 1995. Lupus 4:393-5.(Ishida, H. et al. 1994. J. Exp. Med. 179:305-10)(Jacob, C. O. and McDevitt, H. O.,1988. Nature 331: 356-358)］。我々は、このアンバランスが、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞を強く活性化することによって補正されるという証拠を得て、近年この効果の作用機構を解明した。
【０１３４】
精製されたＴ細胞を、上記概要に沿って調製し、ＴＧＦ−βの存在または不存在で、ＣｏｎＡとＩＬ−２でインキュベーションした。図６では、ＴＧＦ−βの非存在下でのＴ細胞の刺激によって、ＩＬ−１０の産生が増加したことを示す。しかし、ＴＧＦ−αを刺激されたＴ細胞に加えると、ＩＬ−１０の産生が遮断され、ＴＮＦ−αの産生が増加した。さらに、ＴＮＦＲ２の発現が有意に増加した。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βによって誘導されるＴＮＦＲ２を介するＴＧＦ−α情報伝達の促進が、抗体産生を抑制する調節性Ｔ細胞� �生じると考える。我々の結果は、この考察を支持するものであった。
【０１３５】
ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御が調節性Ｔ細胞の誘導に重要であることを説明してきた。図７は、ＴＧＦ−βを活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に添加することで、ＩｇＧ産生の顕著な抑制が起こることを示す。この抑制活性は、主な中間体としてＴＮＦ−αに依存する。これらの各試験において、抗ＴＮＦ−α抗体を中和することによって、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞（ＣＤ８reg）抑制効果を完全になくした。
【０１３６】
ＳＬＥ患者は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少を伴なう細胞仲介免疫に著しい欠失を有する（Horwitz, D.A. et al.,(1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp.83-96, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。理論にしばられるわけではないが、ＴＧＦ−βのリンパ球産生における欠失は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生減少に対する部分的な要因である。ＴＧＦ−βの存在下でのＴ細胞の刺激によって、これらの細胞を再び刺激すると、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生が顕著に増加することを見出した。さらに、この結果は、ＴＧＦ−βによるＴＮＦ−αの上方制御にも依存する（図８を参照）。
【０１３７】
ＴＧＦ−βの産生がＳＬＥで低下し、その欠失がＩＬ−１０とＴＮＦ−αとのアンバランスによるものであるということを示す。理論にしばられるわけではないが、ＳＬＥにおけるＩＬ−１０の高いレベルが、自己抗体産生を保ち、ＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ産生の原因であると考える。� �れらサイトカインの産生低下がＳＬＥにおける欠失性細胞免疫の原因である。明記した条件下で、ＴＧＦ−βはＩＬ−１０を下方制御し、ＴＮＦ−αの産生を強めることを示す。ＴＧＦ−βによるＩＬ−１０の下方制御とＴＮＦ−β産生の増強は、ＳＬＥにおける調節性Ｔ細胞の正常化、細胞仲介免疫の修復、疾病の軽減に関して重大な役割をになう。
【０１３８】
実施例６
細胞仲介自己免疫を抑制する調節性Ｔ細胞の生成
前記実施例では、調節組成物を使用して、抗体介在性自己抗免疫疾患を処置した。類似組成物を使用して、ＣＤ４＋に加えてＣＤ＋８Ｔ細胞を誘導し、細胞仲介自己免疫疾患を抑制した。ＴＧＦ−βによって調節されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞が、Ｔ細胞の細胞毒性の生成を抑制することを� ��す。
【０１３９】
調節性Ｔ細胞を誘導するためにマイトジェンを使用する代わりに、同種異系性混合リンパ球反応を、この目的のために使用した。この反応では、１個体からのＴ細胞が、他の個体のＰＢＭＣによって提示された外来の組織適合性抗原を認識し、応答する。これらの応答Ｔ細胞は、増加して、これらの標的細胞を殺傷する能力を発展させる。
【０１４０】
抑制Ｔ細胞を創生するために、一個体（ドナーＡ）からの様々なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを、別の個体（ドナーＢ）からの照射されたＴ細胞なしの単球性細胞と共に培養した。その細胞を、懸濁液中のＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在または不存在で、５日間培養した。これ以降は、ＴＧＦ−βを除き、該細胞を、新たなドナーＡか� �のＴ細胞とドナーＢ細胞からの非Ｔ細胞に添加した。図９は、ＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方を誘導し、細胞仲介細胞毒性を抑制する能力を開発することを示す。図１０は、ＴＧＦ−βによって誘導されたＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を用いる２つの追加試験を示す。
【０１４１】
さらなる試験によると、この方法でつくった調節ＣＤ４＋Ｔ細胞が、該作用に関する独特の作用を示す。前につくったＣＤ８＋およびＣＤ４＋両方のＴ細胞が阻害性サイトカインの分泌により抑制をおこすのと異なり、これらアロ特異的調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、接触依存性の作用機構を示す（図１１）。理論にしばられるわけではないが、これらの調節性Ｔ細胞は、別のＴ細胞が活性化されるのを抑制すると考える。これら� ��Ｔ細胞の応答Ｔ細胞およびアロ刺激細胞への添加は、増殖を抑制し（図１２）、応答ＣＤ８＋キラー前駆体細胞が活性化される能力を低下させた（図１３）。
【０１４２】
次のことも分かった。これら調節性ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）をそれら細胞表面で発現し、非常に強力である（図１４）。調節ＣＤ４＋細胞の応答Ｔ細胞との割合が、１：４（２０％）から１：３２（３％）に低下すると、これら細胞の阻害効果がごく僅か低下した。
【０１４３】
これら細胞の少量のみを強い下方制御効果に必要とするので、十分な数を患者に移送し、自己免疫性もしくは他の所望の免疫抑制効果、例えば移植拒絶反応を抑制することができる。
【０１４４】
実施例７
ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激して� �ＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成する
ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ３細胞と称されているが、その発生に関する機構は殆ど理解されていない。われわれが得た証拠によると、スーパー抗原、スタフィロコッカス・エンテロトキシン（ＳＥＢ）によるＣＤ４＋細胞の強い刺激、または低濃度のＳＥＢよるＣＤ４＋細胞の反復刺激が、これらの細胞を誘導し、活性ＴＧＦ−βの免疫抑制レベルを生成した。
【０１４５】
図１５は、活性および全ＴＧＦ−βの産生増加が、ＳＥＢ濃度の増加によって刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によりなされたことを示す。図１６は、ＳＥＢの低用量によってＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激に関する効果を示す。Ｔ細胞をＳＥＢで３回刺激すると、顕著な量のＴＧＦ−βの活� ��型が生成した。
【０１４６】
図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの効果を示す。この細胞をＳＥＢで５日ごとに合計３回刺激した。各Ｔ細胞のサブセットおよびＣＤ２５ＩＬ−２受容体活性マーカーを発現する細胞の％を各々の刺激後に測定した。パネルＡおよびＣは、最初の刺激にＴＧＦ−β １ｎｇ／ｍｌが含まれていると、ＣＤ４＋Ｔ細胞が反復刺激の培養物中で優勢なサブセットとなったことを示す。パネルＢおよびＤは、ＳＥＢ刺激細胞によるＣＤ２５の発現が、対照培養物中で３回目の刺激によって低下したことを示す。しかし、ＣＤ２５の発現は、Ｔ細胞がＴＧＦ−βで駆動されると、非常に高いままであった。即ち、ＴＧＦ−βは、これらのＴ細胞が反復刺激されると、ＣＤ４＋細胞に対する優先効果を有するようであり、これらの細胞の殆ど全てが２０日間の培養後にＣＤ２５＋であった。
【０１４７】
要約すると、Ｔ細胞の刺激の結果として、ＴＧＦ−βの優勢な調節効果が、ＣＤ８＋細胞に与えられる。反復刺激によって、このサイトカインはＣＤ４＋細胞を誘導して、調節性細胞とする。この細胞は、抑 制活性に関してＣＤ８＋細胞よりも強力である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２およびＴＧＦ−βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少することを示す。
【図２】図２は、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの両方により、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、抗ＴＧＦ−βがＩＬ−２の効果を逆転することを示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、抗体産生に対するＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、非刺激細胞および抗ＣＤ２刺激細胞によるＴＧＦ−β１のリンパ球産生を示す。
【図６】図６は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のＴ細胞産生に対� �るＴＧＦ−βの作用を示す。
【図７】図７は、ＴＧＦ−βによる調節性Ｔ細胞の生成にＴＮＦ−αが必須の中間体であることを示す。
【図８】図８は、ＴＧＦ−β起動Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカインの産生の増加がＴＮＦ−αに依存性であることを示す。
【図９】図９は、細胞毒性Ｔ細胞活性の抑制物質の産生におけるＴＧＦ−βの作用を示す。
【図１０】図１０は、ＴＧＦ−βにより起動されたＣＤ４細胞のアロ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対する作用を示す。
【図１１】図１１は、調節性Ｔ細胞がＣＴＬ活性を抑制するために細胞接触を必要とすることを示す。
【図１２】図１２は、ＴＧＦ−βで誘発された調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞によるリンパ球増殖の抑制を示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ２５＋ＣＤ ４Ｔ細胞の調節活性を示す。
【図１４】図１４は、調節ＣＤ＋４細胞がその表面でＣＤ２５＋（ＩＬ−２）受容体を発現することを示す。
【図１５】図１５は、少量のブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）でのＴ細胞の反復刺激がＴ細胞を誘発してＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１６】図１６は、低量のＳＥＢでＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激によってＴ細胞がＴＧＦ−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
【図１７】図１７は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＳＥＢの作用を示す。

特許の図